NY∕T 3639-2020 中华猕猴桃品种鉴定 SSR分子标记法(农业)
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ID： |
5407A2F147924248A872555159D2F773 |
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文件大小(MB)： |
0.66 |
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页数： |
15 |
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文件格式： |
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日期： |
2021-12-26 |
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ICS 65.020.01,B 05 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY /T 3639-2020,中华狲猴桃品种鉴定SSR分子标记法,Identification of Actinidia chinensis cultivars using SSR markers method,2020 - 07 - 27 发布2020 -11 - 01 实施,中华人民共和国农业农村部发布,NY/T 3639-2020,目次,前言……"….. .. .…… ………… …ψ ?晻晻?……… ..… H,1 1也1 ff，J …,2 规范性引用文件 .. .,3 术i含辛11定义,4 原理,5 仪器设备及试剂-,6 溶液配制,7 引物相关信息及使用-……..,8 参照品种及其使用,9 操作程序.……………… ………..…..…..……. ,.. ,.. …….. 2,10 判定方法…..,附录A (规范性附录} 主要仪都设备及试剂,附录B (规范性附录) 溶液配11，卜,附录C (规范性附录) 核心引物名单及序列…,附录D (资料性附录) 核心引物相关信息… . …… …… …"… ….. 10,附录以资料性附录) 参照品种名单及来源 . . . .…. .. . .… ………….. 11,I,NY / '1' 3639- 2020,JI,NY/T 3639- 2020,中华狲猴桃晶种鉴定SSR 分子标记法,范围,本标准规定了利用简单重复序列(S impl e Sequcncc Repcats , SSR) 分子标记进行中华Jl~猴桃[Acti n,凶α chill ensis Pl a nchon ，包括中华狲猴桃原变利I ( A ct口lidia ch ille川is Planch. va r. cl川咱们Isis) 和美眯狲猴,桃变利I (J\ ct川idia chinensis Planch. va r.且岳阳帽霄哼?吧v叫屹， ) ] 雌性品种鉴定的术ìfi. 和定义、原理、仪,器设备及试剂、溶液配制、引物相关i銸d雄用飞参照品种及其;厨3蜘l;f程序和l 步1)定方法,本标准适用于,2,下列文,凡是不注日期的引,NY/T 2351,NY/T 2594,3,3. 1,核心引物,品种鉴定,3. 2,待;到样品,4 原理,简单重复序列,能不同。针对每个,Polymerasc chain,同，经过扩增产生不同,因此，根据SSR 位点的多态性,5 仪器设备及试剂,见附录A o,6 溶液配制,见附录B .,7 号 物相关信息及使用,寻 物名单及序列见附录C ，引物等位变异等相关信息参见附录Do,8 参照品种及其使用,本文件,参照品种的名称及来源参见附录E o 在进行待测样品等位变异检测时，应同时包括相应参照品利:的,NY/T 3639- 2020,PCR 扩增产物的检测,注1 . 同名称不同来源的参!!商品种的某一位点上的等位变异可能不相同， 在使用其他来源的参Jm 品种时，应与原参照,品种核对，确认无误后使用,注2: 对于附录E 中未包括的等位变异，应按本标准方法，通过使用阶认分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小.,9 操作程序,9. 1 样晶制备,试验样品为中华狲猴桃的~J嫩n l 片，每份样品中至少随机灿收3 个单株，进行混样分析。当一致性结,果较差时，进行单独~样分析,9.2 DNA 提取,a) 勒i驭中华狲猴桃幼嫩叶片0 . 25 g ，放入- 20'C 预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨多次，至粉末状,后，立即装入2 mL 离心管巾，依次加入1. 5 m L 预热(70'C) 的2 % CTA?提取缓冲液、4 5 μL 仕,硫基乙醉， 充分挤匀,b) 65'C 恒j6ft水浴1 h ，期间每隔1 0 min 翻转离心管数次。1 2000 r/ min ， 4'C 离心15 min.,c) llR上清液， 力11 入等体积的氯仿: 异戊膨(24 : l， V/V)， 轻轻颠倒混匀，于常温下静置10 min ,12000 r/ min ， 4'C 离心1 5 min.,d) 取上清液，加入等体积的氯仿，颠倒混匀， 12000 r/ mi n ， 4'C 离心1 5 mi n.,c) 1段上清液，加入2 倍体积20'C 预冷的元水乙醉，颠倒混匀，在一20'C 下静宜30 min: 12 000,r/ min ， 4'C离心1 0 min ，弃上清液,f) 沉淀的DNA 用7 5% 乙醇浸泡沾一洗沉淀2 次，弃乙醉，离心管置于通风橱中风干，将沉淀物溶解,于200μL 双蒸水中， 加lμL 10 g/ L 的RNasc A ， 37'C 泪浴30 min , -20'C保存备用,g) 用75% 乙醉浸泡清洗沉淀2 次，风干，将沉淀物榕解于200 μL 双蒸水中,h) 利用NanoDrop 分光光度计检视~DNA 浓度，将DNA 浓度稀释到50 ng/ mL 左右， - 20'C保存备用,注， 以上为推荐的DNA 提取方法，其他达到IJPCR 扩增质盐要求的DNA 提取方法均适用.,9.3 PCR 扩增,9. 3. 1 反应体系,PCR 反应体系为20μ L: lO X Bu [fcr ( 含Mg2+ ) 2. 0 I'L, 2. 5 mmoi/L dNTP5 2. 0 μ L ，样品DNA 2. 0,μL ， EX Taq 酶(5 U/μLJ O .2μL，正向和反向引物00 mmo i/ L) 各1. 0 μL ，双蒸水1 1. 8μL ,利用毛细管电泳荧光检测n才使用荧光……
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